تعیین مقدار اسید اگزالیک در میوه‌ها و سبزیجات با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)

تعیین اسید اگزالیک سنجش میزان آن در میوه‌ها و سبزیجات با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)
۱. اصول و طراحی روش آزمایش
به عنوان یک اسید آلی رایج در میوه‌ها و سبزیجات، محتوای اسید اگزالیک مستقیماً بر طعم و ارزش غذایی غذا تأثیر می‌گذارد. این آزمایش از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا فاز معکوس (RP-HPLC) استفاده می‌کند. در شرایط فاز متحرک اسیدی، اسید اگزالیک با استفاده از یک ستون کروماتوگرافی C18 از مواد مزاحم در حالت پایه جدا می‌شود. یک آشکارساز فرابنفش در طول موج 210 نانومتر برای تجزیه و تحلیل کمی، بر اساس ویژگی‌های جذب UV گروه‌های کربوکسیل در مولکول‌های اسید اگزالیک، استفاده می‌شود.
۲. منحنی استاندارد و آماده‌سازی نمونه
برای تهیه محلول‌های استاندارد از روش رقت گرادیانی استفاده می‌شود: 25.0 میلی‌گرم اسید اگزالیک دی‌هیدرات را با دقت وزن کنید و با آب فوق خالص تا 25 میلی‌لیتر رقیق کنید تا محلول استوک 1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر به دست آید. این محلول به صورت متوالی در مجموعه‌ای از محلول‌های استاندارد با غلظت‌های 50، 100، 200، 400 و 800 میکروگرم بر میلی‌لیتر رقیق می‌شود و هر غلظت در سه تکرار تزریق می‌شود.
برای آماده‌سازی نمونه، از استخراج به کمک مایکروویو استفاده می‌شود: 5.00 گرم از هموژنات میوه/سبزی را وزن کنید، 10 میلی‌لیتر محلول اسید هیدروکلریک 0.1 مول بر لیتر اضافه کنید، به مدت 10 دقیقه در دمای 60 درجه سانتیگراد با مایکروویو قرار دهید، از یک فیلتر غشایی 0.45 میکرومتری عبور دهید و محلول صاف شده را برای آزمایش جمع‌آوری کنید.
۳. بهینه‌سازی شرایط کروماتوگرافی
فاز متحرک یک سیستم بافر دی هیدروژن فسفات پتاسیم (pH 2.5) - استونیتریل (95:5) با غلظت 0.01 مول بر لیتر است که سرعت جریان آن 0.8 میلی‌لیتر بر دقیقه و دمای ستون 35 درجه سانتیگراد است. تنظیم نسبت استونیتریل نشان می‌دهد که وقتی فاز آلی از 10٪ بیشتر شود، زمان ماند اسید اگزالیک به کمتر از 3 دقیقه کاهش می‌یابد، اما پیک دم کردن رخ می‌دهد. تحت شرایط بهینه نهایی، زمان ماند اسید اگزالیک 4.2 دقیقه است که جداسازی کامل از اسید سیتریک و اسید مالیک مجاور را محقق می‌کند (رزولوشن > 1.5).
۴. اعتبارسنجی روش
تأیید دامنه خطی، رابطه خطی خوبی بین مساحت پیک و غلظت در محدوده 10 تا 1000 میکروگرم بر میلی‌لیتر نشان می‌دهد (R² = 0.9993). حد تشخیص (LOD)، که با روش نسبت سیگنال به نویز تعیین می‌شود، 0.5 میکروگرم بر میلی‌لیتر است. در آزمایش‌های تکرارپذیری، RSD برای شش تکرار تعیین‌شده از همان نمونه اسفناج 1.8٪ است. آزمایش‌های بازیابی اسپایک در سه سطح (80٪، 100٪ و 120٪) به ترتیب میانگین بازیابی 98.2٪، 102.4٪ و 97.8٪ را به همراه دارد که الزامات تجزیه و تحلیل کمی را برآورده می‌کند.
۵. آنالیز نمونه‌های واقعی
شش میوه و سبزیجات موجود در بازار مورد آزمایش قرار گرفتند: اسفناج (۱۲ ± ۳۵۶ میلی‌گرم در ۱۰۰ گرم)، کرفس (۹ ± ۲۱۵ میلی‌گرم در ۱۰۰ گرم)، گوجه‌فرنگی (۲ ± ۱۸ میلی‌گرم در ۱۰۰ گرم)، سیب (۱ ± ۶ میلی‌گرم در ۱۰۰ گرم)، موز (شناسایی نشده) و کلم بروکلی (۵ ± ۸۹ میلی‌گرم در ۱۰۰ گرم). مقایسه با روش استاندارد ملی (GB 5009.277-2016) نشان می‌دهد که انحراف نسبی بین دو روش کمتر از ۵٪ است، که قابلیت اطمینان این روش را تأیید می‌کند. به طور خاص، روش HPLC هنگام تجزیه و تحلیل نمونه‌های با محتوای کم، حساسیت بالاتری نسبت به روش‌های سنتی تیتراسیون نشان می‌دهد.
۶. نکات کلیدی
در طول پیش‌تیمار نمونه، مقدار pH را به شدت کنترل کنید. اگر pH عصاره از ۳ بیشتر شود، رسوب اگزالات کلسیم منجر به نتایج آزمایش پایین خواهد شد. فاز متحرک باید روزانه و تازه تهیه شود تا از رسوب نمک و انسداد ستون جلوگیری شود. پس از هر ۲۰ تزریق، ستون را به مدت ۳۰ دقیقه با استونیتریل-آب (۳۰:۷۰) بشویید تا از کاهش کارایی ستون جلوگیری شود. برای نمونه‌های حاوی رنگدانه (مثلاً کلم بنفش)، توصیه می‌شود قبل از تزریق، یک مرحله خالص‌سازی استخراج فاز جامد اضافه شود.
۷. دستورالعمل‌های کاربرد و توسعه
این روش را می‌توان برای تشخیص اسید اگزالیک در نمونه‌های بیولوژیکی مانند ادرار و خون نیز به کار برد. با تنظیم ترکیب فاز متحرک (مثلاً افزودن تترابوتیل آمونیوم هیدروکسید)، اسید اگزالیک و متابولیت‌های آن را می‌توان به طور همزمان تعیین کرد. در ترکیب با یک آشکارساز طیف‌سنجی جرمی، می‌توان یک روش تشخیص دقیق‌تر مقادیر ناچیز ایجاد کرد. در صنعت فرآوری مواد غذایی، این روش می‌تواند داده‌های مهمی را برای انتخاب انواع کم اسید اگزالیک و بهینه‌سازی فرآیندهای پخت و پز فراهم کند.